一、ELISA基本原理
ELISA通过抗原-抗体的特异性结合,利用酶催化底物显色反应进行定量或定性分析。常见的类型包括直接法、夹心法和竞争法,但其核心步骤均依赖于以下三类关键试剂。
二、核心试剂一:包被抗体/抗原——实验的“基石"
作用:作为固相载体(微孔板)的固定化分子,捕获目标物。
纯度与活性:高纯度避免交叉反应,确保结合效率(建议使用单克隆抗体)。
包被浓度优化:预实验确定最佳浓度(通常1-10 μg/mL),浓度过高易导致空间位阻。
缓冲液选择:碳酸盐缓冲液(pH 9.6)常用,避免含BSA或Tween的溶液。
常见问题:
非特异性结合:增加封闭步骤(如5%脱脂牛奶或BSA封闭1小时)。
包被不均:4℃过夜包被优于室温2小时,提高结合稳定性。
三、核心试剂二:酶标抗体——信号的“放大器"
作用:与目标物结合后催化底物显色,将生物学信号转化为光学信号。
HRP(辣根过氧化物酶):常用,底物为TMB(显蓝色)或OPD(显黄色),灵敏度高。
AP(碱性磷酸酶):底物为pNPP(显黄色),适用于磷酸盐缓冲体系。
标记效价:高效价减少用量,降低成本(建议效价≥1:5000)。
保存条件:HRP需避光保存,避免反复冻融(分装后-20℃储存)。
注意事项:
避免与叠氮钠(HRP抑制剂)共用,可选择ProClin 300作为防腐剂。
四、核心试剂三:底物显色系统——结果的“可视化"
作用:酶催化底物生成有色产物,通过吸光度值定量目标物浓度。
常用底物对比:
优化技巧:
显色时间控制:室温避光反应10-30分钟,避免过度显色导致背景升高。
终止时机:当标准品最高浓度孔显色明显时立即终止。
五、实验流程关键步骤
包被:100μL/孔,4℃过夜。
封闭:含1% BSA的PBS,37℃1小时。
加样:样本梯度稀释,37℃孵育1小时。
酶标抗体孵育:37℃1小时,洗涤3次(0.05% Tween-20 PBS)。
显色与终止:TMB显色15分钟,2M H?SO?终止。
读数:双波长检测(450 nm/630 nm校正孔间误差)。
六、常见问题与解决方案
高背景噪音:增加洗涤次数(5次以上),检查封闭液是否失效。
低信号值:优化包被浓度或延长底物孵育时间。
孔间差异大:使用多通道移液器,确保加样一致性。