一．原理
　　
　　RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。对某一生物或组织进行性状研究，首先要获得该性状基因，从组织细胞中分离完整的RNA对于分子克隆和基因表达分析等实验是至关重要的，如Northern印迹及杂交分析、cDNA合成等实验的成效在很大程度上取决于RNA的质量。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定量的检测，从分子水平的了解细胞生命活动的规律。通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5μgRNA，其中80%～85%为rRNA（主要是28S、18S和5.8S、5S四种类型）；10%～15%为tRNA和核内小分子RNA。
　　
　　这些高峰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量1%～5%的为mRNA。mRNA虽然大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等，但大多数真核细胞mRNA在其3''端均有一寡聚腺苷酸（polyA）组成的尾，其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸―纤维素[oligo（dT）]，使得mRNA可以利用亲和层析法分离。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。研究表明RNA极不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是zui大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。
　　
　　对内源性RNA酶，主要运用RNA酶抑制剂，目前常用的RNA酶抑制剂有：
　　
　　①RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin），它是从人胎盘分离的一种蛋白质，可以与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的复合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白质抑制剂制品经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶的蛋白质抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译；
　　
　　②氧钒核糖核苷复合物，它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态似物，它能与多种RNA酶结合并抑制RNA酶活性。然而氧钒核糖核苷复合物能强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
　　
　　③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后续的RNA纯化过程中经离心除去；
　　
　　④异硫氰酸胍，它是强力的蛋白质变性剂，在破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来的同时也使RNA酶变性失活；
　　
　　⑤焦碳酸二乙酯（DEPC），它是RNA酶强烈抑制剂，但其作用并不是的。DEPC主要用于不能高压灭菌的材料和器皿的RNA酶处理；
　　
　　⑥其它化学试剂，如SDS、尿素等对RNA酶也有一定的抑制作用。
　　
　　对外源性RNA酶主要通过以下几个途径污染RNA制品：
　　
　　①玻璃制品、塑料制品和电泳槽；
　　
　　②研究人员造成的污染；
　　
　　③污染的溶液。
　　
　　因此在实验中必须采取下列措施抑制外源性RNA酶：
　　
　　①实验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤3h以上（玻璃制品）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15min。RNA电泳槽需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水*冲洗电泳槽。灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不需要处理；
　　
　　②在RNA提取过程中,应戴一次性手套,对接触可能污染的器皿时，应勤换手套；
　　
　　③配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC水在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂，用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。
　　
　　真核细胞总RNA制备方法有多种，包括异硫氰酸胍—氯化铯超速离心法、盐酸胍—有机溶剂法、氯化锂—尿素法以及热酚法、异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol试剂提取法等。目前实验室提取总RNA的常用方法为异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol试剂提取法。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA，是将已知zui强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了核蛋白复合物的解离，使RNA和蛋白质分离并进入溶液，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩。
　　
　　二．材料与方法
　　
　　1材料
　　
　　实验鱼，购于市场。
　　
　　2仪器、用具
　　
　　台式离心机、恒温水浴锅（70℃）、分析天平、移液器、一次性注射器、方盘、镊子、手术剪、培养皿、1.5ml离心管。
　　
　　3试剂
　　
　　95%的RNase-free乙醇；0.1%DEPC处理水；SVRNALysisBuffer；SVRNAdilutionBuffer；SVRNAWashSolution；YellowcoreBuffer；MnCl2；0.09M；DNaseⅠ；SVDNaseStopSolution；Nuclease-Freewater。
　　
　　4方法
　　
　　1）材料的准备
　　
　　（1）将培养皿、剪刀、眼科镊灭菌，-20℃预冷。
　　
　　（2）用泡沫盒盛装碎冰，将培养皿置于冰上，将剪刀、镊子置于培养皿中。
　　
　　（3）用桶盛装碎冰，加入少量的自来水，用纱布包裹鱼放入桶中。
　　
　　（4）将已麻痹的鱼置于方盘中，用剪于肛门向前及斜向上将腹腔剪开，取出内脏，分离肝脏置于培养皿中。
　　
　　（5）取1.5ml的离心管于分析天平上，调零。
　　
　　（6）用镊子取20-30mg的肝脏组织于1.5ml的离心管中，称重。
　　
　　2）实验操作
　　
　　（1）取约30mg组织于1.5ml离心管中，加入175μlSVRNALysisBuffer，用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混匀。
　　
　　（2）加350μlSVRNADilutionBuffer（蓝色），翻转管子3-4次混匀，置70℃水浴3min。
　　
　　（3）冰上冷却1-2秒，14000rpm离心10min，上清液移入一新离心管。
　　
　　（4）加入200μl95%的乙醇，枪头混匀。
　　
　　（5）将上述混合液移入SpinBasketAssembly，14000rpm离心1min，弃滤液。
　　
　　（6）加入600μlSVRNAWashSolution（withethandadded），14000rpm离心1min，弃滤液。
　　
　　（7）在一新离心管中配制DNaseincubationmix：
　　
　　YellowCoreBuffer40μl
　　
　　MnCl20.09M5μl
　　
　　DNaseⅠ5μl
　　
　　（8）将上述50μl混合液直接加在SpinBasket的膜上，室温（20-25℃）保育15min。
　　
　　（9）加200μlSVDNaseStopSolution（withethandadded）至SpinBasket14000rpm，离心1min。
　　
　　（10）加600μlSVRNAWashSolution，14000rpm离心1min，弃滤液。
　　
　　YellowcoreBuffer40μlMnCl2，0.09M5μlDNaseI5μl
　　
　　（11）加250μlSVRNAWashSolution，14000rpm离心2min，将SpinBasket转移到一新离心管中。
　　
　　（12）加50μlNuclease-FreeWater至膜上，14000rpm离心1min，溶解RNA，-20℃保存。
　　
　　（13）取5μlRNA样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
　　
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