您听说过酶切技术吗?每一种实验方法技术都是有它的实验原理与目的的。那么酶切技术呢?问题既然是我们提出的,那么就由我们来为您解答。
酶切可以获得粘性末端进行连接,它用于验证DNA重组是否成功,还用于验证质粒酶切位点是否有效。我们下面就来看看那些个步骤详解,恒远实验“单双”酶切。
实验之前上海恒远为您整理出了所需要用到的材料试剂:
我们把实验的材料准备好了之后就可以进入实验的操作过程了,本文的标题中,“单双”酶切您怎么理解?我们来依次看看。
首先来看单酶切:
1、我们在在1.5 mL灭菌离心管中依次加入质粒DNA:X μL(约1 μg)、限制性内切酶:1 μL(约10 U)、10×buffer:2 μL、ddH2O:补足20 μL。
2、混匀,做好标记。
3、37℃水浴1-3 h。
4、70℃水浴10 min中止反应。
5、电泳检测酶切效果。
双酶切:
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入质粒DNA:X μL(约1 μg)、限制性内切酶1:1 μL(约10 U)、限制性内切酶2:1 μL(约10 U)、10×buffer:1或2 μL、ddH2O:补足20 μL。
2、混匀,做好标记。
3、37℃水浴1-3 h。
4、70℃水浴10 min中止反应。
5、电泳检测酶切效果。
实验结束之后要怎么去分析其结果呢?我们假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切*,紫外灯下检测电泳结果,则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不*。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样,比如说超螺旋、线性和开环三条带,则说明质粒*没有被切开。
您在操作实验的过程中也要注意,您酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系,这样抑制因素得以稀释;基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大,一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10,否则甘油浓度会超过5%,会产生星号活力;对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr, 甚至过了一个晚上。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具体每一种酶可能有些方法不能*灭活,这一点需要您多要注意。
今天的文章到这里就结束了,实验中的材料、步骤以及zui后需要注意的事项我们都为您总结出来了,如果您还有其它实验、产品、技术方面的问题都可以我公司的,上海恒远非常感谢您的支持!