实验有其目的有其原理，您看题目知道我们本次的实验是查看细胞的生长存活，我们今天使用的方法名称为四唑盐比色法，四唑盐也叫MTT。本次实验有些特别哦！实验的作用出标题中目的，还有两个，它还可以大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定、生物活性因子的活性检测。
    一次实验，四种作用：用四唑盐比色法实验查看细胞的生长与其存活。在实验之前您需要先了解一下应该明确知道哪些问题，当然啦，上海恒远已经为您整理出来了，下面我们来分条逐步看：
    1、选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
    2、药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。不然可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
    3、时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，zui后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了那个时间点应该就是的时间点，因为这个时候的细胞增殖抑制表现的zui明显。
    4、培养时间。200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48 h换液的。
    5、MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
    6、理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
    7、实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
    8、避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
    第二部是贴壁细胞：
    1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ul，铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔，边缘孔用无菌PBS填充。
    2、5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。
    3、5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
    4、每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
    5、终止培养，小心吸去孔内培养液。
    6、每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
    7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
    做完了贴壁细胞之后，我们再看看悬浮细胞：
    1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将
① 补足的1640（无血清）培养基40 ul ；
② 加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释 （储存液100 ug/ml，需预试寻找*稀释度，1：10-1：20）；
③ 需检测物10 ul；
④ 细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 ul 1640）。
    2、置37℃，5% CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
    3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
    4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 
    5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
    MTT的配制：一般现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就不能再用了。
    上海恒远提醒您：MTT有致癌性，用的时候小心，有条件带那种透明的簿膜手套。配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
    配制MTT时用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
1、PBS配方
① NaCl ：8 g。
② KCl 0.2：g。
③ Na2HPO4 ：1.44 g。
④ KH2PO4：0.24 g。
⑤ 调pH7.4。
⑥ 定容1 L。
    zui后一步啦，细胞的接种（铺板）：
    细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时按照预实验摸索出的密度接种， 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系，结果zui可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，zui后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。
    细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。
    到这里就算是基本说完了，本实验有点复杂，所以朋友们要小心并且有耐心哦！zui后呢，上海恒远在这里再给朋友们说说实验中有哪些注意事项。首先就要选择适当得细胞接种浓度，还有要避免血清干扰，一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验，在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，zui后比色以空白调零。MTT实验吸光度zui后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。
    一次实验，四种作用。感谢您对本公司的支持，我公司的产品质量都是可以保证的，并且试剂盒提供免费代测，其它产品实验中，您有任何问题都可以来电，我们可提供实验技术指导。欢迎您电询上海恒远何。