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一次实验,四种作用:用四唑盐比色法实验查看细胞的生长与其存活
更新时间:2014-03-06      阅读:1621

    实验有其目的有其原理,您看题目知道我们本次的实验是查看细胞的生长存活,我们今天使用的方法名称为四唑盐比色法,四唑盐也叫MTT。本次实验有些特别哦!实验的作用出标题中目的,还有两个,它还可以大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定、生物活性因子的活性检测。
    一次实验,四种作用:用四唑盐比色法实验查看细胞的生长与其存活。在实验之前您需要先了解一下应该明确知道哪些问题,当然啦,上海恒远已经为您整理出来了,下面我们来分条逐步看:
    1、选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
    2、药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。不然可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
    3、时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,zui后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了那个时间点应该就是的时间点,因为这个时候的细胞增殖抑制表现的zui明显。
    4、培养时间。200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68 h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48 h换液的。
    5、MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
    6、理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
    7、实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
    8、避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
    第二部是贴壁细胞
    1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100 ul,铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔,边缘孔用无菌PBS填充。
    2、5% CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100 ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。
    3、5% CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
    4、每孔加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),继续培养4 h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
    5、终止培养,小心吸去孔内培养液。
    6、每孔加入150 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
    7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
    做完了贴壁细胞之后,我们再看看悬浮细胞
    1、收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将
① 补足的1640(无血清)培养基40 ul ;
② 加Actinomycin D(有毒性)10 ul用培养液稀释 (储存液100 ug/ml,需预试寻找*稀释度,1:10-1:20);
③ 需检测物10 ul;
④ 细胞悬液50 ul(即5×104cell/孔),共100 ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100 ul 1640)。
    2、置37℃,5% CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
    3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)
    4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。 
    5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
    MTT的配制:一般现用现配,过滤后4oC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就不能再用了。
    上海恒远提醒您:MTT有致癌性,用的时候小心,有条件带那种透明的簿膜手套。配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
    配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
1、PBS配方
① NaCl :8 g。
② KCl 0.2:g。
③ Na2HPO4 :1.44 g。
④ KH2PO4:0.24 g。
⑤ 调pH7.4。
⑥ 定容1 L。
    zui后一步啦,细胞的接种(铺板)
    细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系,结果zui可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,zui后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100 ul/孔。
    细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。
    到这里就算是基本说完了,本实验有点复杂,所以朋友们要小心并且有耐心哦!zui后呢,上海恒远在这里再给朋友们说说实验中有哪些注意事项。首先就要选择适当得细胞接种浓度,还有要避免血清干扰,一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验,在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,zui后比色以空白调零。MTT实验吸光度zui后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。
    一次实验,四种作用。感谢您对本公司的支持,我公司的产品质量都是可以保证的,并且试剂盒提供免费代测,其它产品实验中,您有任何问题都可以来电,我们可提供实验技术指导。欢迎您电询上海恒远何。

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