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人类白细胞抗原 B27检测方法及意义
更新时间:2014-08-01      阅读:6857

                    人类白细胞抗原 B27检测方法及意义

HLA是组织细胞上受遗传控制的个体特异性抗原,zui早是在白细胞和血小板上发现的,现在发现该抗原广泛分布于皮肤、肾、脾、肺、肠和心等组织器官有核细胞的细胞膜上。第8次组织相容性会议确定HLA有92个,分属于A、B、C、D和DR5个位点,分别称为HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-D和HLA-DR。HLA-B位点有42个,B27为其中之一。现已证明HLA-B27阳性者比HLA-B27阴性者发生强直性脊柱炎的机会要大得多。

2 HLA B27检测意义

临床意义:强直性脊柱炎病人HLA-B27的阳性率为90%。瑞特综合征的阳性率为80%。有报导说,HLA-B27阳性的正常人中大约有8%日后发展为强直性脊柱炎的可能。

3 本试剂盒采用检测方法

本试剂盒采用TaqMan 的荧光PCR方法,结合序列特异性PCR(PCR-SSP)技术。从GenBank中选取已公布的所有HLA亚型,进行序列比对后设计一对特异性引物和一条特异性荧光探针,既提高了检测灵敏度、准确性,又使检测简便快速,反应结束后直接分析判读,无需电泳检测。

4 试剂盒性能参数

便捷性:本试剂盒采用碱裂解法提取外周血DNA,操作过程方便快捷,从提取到结果判断全程耗时小于90分钟,适用于市面上的多款荧光PCR仪。

准确性:对检测出150例阳性标本进行测序分析,准确性达到100%。

灵敏度:zui低检测约为1000 Copies/ml,对DNA的要求浓度低,线性范围1×103-1×109,重现性好。

特异性:与One Lamda HLA B27试剂进行比较,结果一致性达到99.4%(359/361)。

安全性:本试剂盒采用PCR-荧光探针技术,避免了PCR-SSP单一技术扩增后产物经凝胶电泳EB染色,避免了致癌物质接促及PCR产物污染等问题。

强直性脊柱炎B27检测试剂盒(磁酶联免疫法)

英文名称:HLA-B27 Assay Kit

【包装规格】

   48人份/

【简 介】

    HLA-B27与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)强相关。AS在我国的患病率为0.3%,其中90%-98%的患者出现HLA-B27阳性。因此,B27的检测对排除AS的诊断有辅助作用并有助于早期发现B27抗原的存在,对于患者及早进行相应的干预措施具有指导意义。本试剂盒提供含有抗HLA-B27抗体的磁珠,特异性针对人白细胞抗原B27

【预期用途】

    本试剂盒主要用于检测人全血中B27抗原是否存在,作为强直性脊柱炎的鉴别诊断。

【检验原理】

    本试剂盒应用磁珠分离法,在高品质磁珠上耦联B27抗体,与全血中白细胞上的B27抗原反应,同时,加入HRP标记的抗体联结至白细胞上。经洗涤后,磁珠上含有B27抗原的细胞和酶均被保留下来。加入底物液显色,终止反应后在酶标仪450nm读取吸光度值。

【主要组成成份】

本试剂盒包含以下组分:

  1. MICROPLAT -包被抗体的微孔板条

REF PC-01A

孔内包被HLA-B27磁珠的抗体,微孔板条6×8孔条,包装于带干燥剂的铝箔袋中。

  1. ENZYMCONJ-酶结合物(REF PC-01B

HRP标记的抗细胞抗体,每瓶60µl

  1. ENZYMDIL-酶稀释液(REF PC-01C

用于稀释酶结合物,每瓶3ml

  1. WASHBUF 20×—浓缩洗液(REF FC-01D

含吐温的磷酸缓冲液,每瓶10ml

  1. SUBSA -TMB底物液AREF PC-SUBSA 

每瓶3 ml

  1. SUBSA -TMB底物液BREF PC-SUBSB 

                         每瓶3 ml

  1. PC阳性对照品(REF PC-PC

每瓶300 ul

  1. PC阴性对照品(REF PC-NC

每瓶300 ul

  1. STOP终止液(REF PC-STOP

每瓶3 ml

10. 微孔板架          1

11.文件              说明书1

 

【储存条件及有效期】

试剂盒储存于2-8可保存至试剂盒上所标示的zui后有效期日。

未使用完的微孔板条应放回至有干燥剂的铝箔袋中,将铝箔袋折好并密封于塑料封口袋中,2-8下可保存8周。

洗液开封后在室温下可保存8周。

【样本采集和保存条件】

   EDTA-K3抗凝的全血样本(静脉采血),已打开过的、已污染的、已溶血的、已凝结的血液样本可能引起不一致的测试结果,应避免使用。不能立即使用的样本应静置(竖立)保存于2-8ºC,不超过5天使用。

【额外需要的材料和设备】

1.  EDTA-K3抗凝管

2.  可调微量移液枪0.5-10ul20-200ul,八道加样枪和枪头

3.  磁板(可重复使用)

4.  振荡器

5.  计时器

6.  能够测量波长为450nm的酶标仪

7.  去离子水

8.  真空负压泵(可选项,洗板时使用,有助于实现洗板*)

【检验方法】
试剂准备

  1. 取出所有试剂和待测样本,平衡至室温。
  2. 对样本、阳性对照品、阴性对照品进行编号并记录。
  3. 取出所需微孔板条,其余放回密封袋中封好, 2-8保存。
  4. 将酶结合物60 ul加入至酶稀释液中,确保充分混匀。混匀后的溶液称为酶结合物溶液。
  5. 用去离子水或蒸馏水稀释浓缩洗液(201)。室温下保存。

检测步骤

  1.   加入酶结合物溶液50ul至每一微孔中,轻拍板架,使磁珠分散。
  2.   将抗凝管(EDTA-K3)轻轻颠倒混匀数次, 按记录单中的安排分别加入样本、阳性对照品、阴性对照品各50ul。轻拍板架数次,使磁珠和样本充分混匀。
  3.   将板架放置于振荡器上(200/分钟),室温下反应10-15分钟。
  4.   加入洗液250ul后,将板架置于磁板上静置2
     
    分钟(一定要等散开的磁珠被磁板吸附到底
      部), 再甩板或采用真空负压泵吸取液体。
      注意:采用真空负压泵吸出洗液后,把板架从
      磁板上取下,用手轻叩板架边缘数次,看到磁
      珠散开后,再加入洗液,每次清洗皆如此重复。
  5.   每孔再加入洗液250ul。利用加入时的冲击力使磁珠分散,如发现有聚团,轻拍板架使磁珠分散。将板架放于磁板上,静置2分钟。再甩板或采用真空负压泵吸取液体。
  6.   重复5步骤共4次。
  7.   每孔加入底物A液、B液各50uL。轻拍板架使之充分混合后,室温下避光放置15分钟。

注:底物液易受污染,仅移取检测时所需的量,未用完的底物液须丢弃。

  1.   每孔加入终止液50uL
  2.   将板架置于磁板上,使磁珠吸于微孔侧壁。
  3.   轻轻取下板架,在30分钟内将板架置于波长
      450nm下,读取吸光度值(OD)。
     

【参考值(参考范围)】
每个实验室应建立自己的参考范围。

  1. 阳性:样本 OD值≥0.8
  2. 阴性:样本 OD值≤0.4

【检验结果的解释】

OD值在0.4-0.8,请重复实验,必要时用其它方法验证。

【产品性能指标】

批内差异:≤15%

批间差异:≤15

准确性:检测阴性和阳性对照吸光度,测试结果应在其允许范围内。

【检验方法的局限性】

诊断结果应结合患者的临床症状和医师其他的实验室的检查进行分析。

【注意事项】

  1. 本试剂盒仅供人体外诊断,不得内用,须严格按照说明书进行操作。因未按说明书要求操作引起的损失及责任公司不予承担。
  2. 本试剂盒包含人和/或动物来源的材料。盒中试剂应作为有潜在传染性因子来处理储藏操作和处理试剂应有适当的预防措施和良好的实验室操作。试剂的处理应符合当地法令。
  3. 终止液对眼睛和皮肤有刺激。如不慎与眼接触, 立刻以大量的水清洗,并寻求专业医师帮助。操作本试剂盒时请穿戴适当的防护服和手套。
    1. 底物对皮肤接触或吞咽都是有害的穿戴

适当的防护服和手套。

 

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