双抗夹心ELISA检测食品中大肠杆菌O157-H7方法研究

                           ELISA *包被浓度确定

    包被是 ELISA 实验中关键的一步，如果浓度过低， 包被液中的蛋白质不能*覆盖固相载体表面，随后加入的特异性抗体和酶标二抗就有可能直接被吸附到固相载体上，zui后产生非特异性显色而使检测结果偏高；浓 度过高，蛋白质分子的相互作用影响聚苯乙烯与蛋白质 之间的吸附，以至在随后的抗原抗体反应、洗涤等步 骤中，部分抗原或与抗体结合释放到洗涤液中被弃去， 或直接释放到洗涤液中造成抗原的浪费，因此，在 ELISA 测定中首先要测定合适的包被浓度。

                           双抗夹心 ELISA 的反应时间

   在保证 ELISA 有效检测病原菌的前提下，快速、方 便也是双抗夹心 ELISA 的必要条件。双抗夹心 ELISA 从 加入待测抗原到得出结果，检测大肠杆菌 O157:H7 共需 要 5h 左右，而间接 ELISA 则需要 7h(包被 37℃，2h)或 者 17h(包被 4℃guo夜)。本论文筛选出的双抗夹心 ELISA 检测大肠杆菌 O157:H7 省去封闭这一步骤。在间接 ELISA 测定抗原中，封闭一般是*的，因为包 被不同浓度抗原不一定可以*覆盖固相载体表面，如 果不封闭，很可能使随后加入的特异性抗体和酶标二抗 直接被吸附到固相载体上，产生非特异性显色而使检测 结果偏高。但是对于双抗体夹心 ELISA 来说，在包被 捕获抗体时已经使固相载体饱和，已经没有多余的吸附 力来吸附随后加入的特异性抗体和酶标二抗，这都说明 了双抗夹心 ELISA 有不需要封闭的可能，通过正交试验 结果也证明不封闭可以达到理想实验效果，而且还缩短 了整个检测流程和时间，说明只要酶标记物是高活性的 并且操作时洗涤*，不经封闭也可得到满意结果。双抗夹心 ELISA 检测法的特异性和灵敏性 抗原抗体的结合实际上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空 间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特 异性。但这种特异性并不是的，假使两种化合物 有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可能出现交叉 反应。本实验以大肠杆菌 O157:H7 及其他菌株共 10 株作 为抗原用来检测本方法的特异性，结果显示大肠杆菌 O157:H7 呈明显阳性反应，其余各菌株均呈阴性反应， 说明本方法对大肠杆菌 O157:H7 具有明显的检测特异 性，而对所测定的其它菌株无交叉反应。

   本论文所建立的双抗夹心 ELISA 方法对纯培养的 大肠杆菌 O157:H7 检出限均105CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的双抗夹心 ELISA 检测大肠杆菌 O157:H7 的检测限为 10 5 CFU/ml ，赵志晶和刘秀梅[7] 建立的双抗夹心ELISA 检测大肠杆菌 O157:H7 的检测限为 104CFU/ml，两 者均用单克隆抗体作为检测抗体，而本方法使用 IgY 抗 体与兔多克隆抗体，制备相对比单克隆抗体简单，对试 剂、成本要求也相对降低，其效果基本达到检测要求。

                                   结  论

    本研究通过水稀释法及硫酸铵盐析法纯化抗大肠杆 菌 O157:H7 IgY，10mg/ml 纯化 IgY 的效价为 1:320。以 大肠杆菌 O157:H7 免疫新西兰大耳白兔，获得了抗大肠 杆菌 O157:H7 的多克隆抗体，效价可达 1:25600。确定 双抗夹心 ELISA 检测条件的正交实验分析表明，捕获抗 体于 37℃包被 2h、不封闭、与抗原于 37℃结合 2h、检 测抗体浓度为 0.25mg/ml、与抗原于 37℃结合 1h 为* 条件。该方法稳定性、重复性良好，对纯培养菌液检 出限为 105CFU/ml，具有良好的敏感性及特异性，为快 速检测大肠杆菌 O157:H7 奠定坚实基础。染菌食品在 EC 增菌液中培养后进行双抗夹心 ELISA 检测，含有 0.1～

1CFU/ml 大肠杆菌 O157:H7 的样品在增菌 12h 后可以检出 阳性反应，含有 1～10CFU/ml 大肠杆菌 O157:H7 的样品 在增菌 8h 后可以检出阳性反应，延长培养时间对于检 测结果无意义。