我们在做WB时zui常遇到的问题也是惊人的相似——样品漂浮、蛋白条带扭曲（无法准确判断蛋白分子量）、转膜后看不到带蓝色或橙色的指示条带、抗体孵育不均匀导致曝光度差异很大（依然是会影响到蛋白表达量的估算）。

     这些问题其实都或多或少与样品前处理有关。也就是说，我们*可以通过优化样品处理手法，以及经验累积，来获得的WB结果。

     1.出现样品漂浮怎么办？？

     原因分析：样品中含有未除净的溶剂或杂质，其密度比电泳缓冲液小

     解决办法：处理组织或菌体时，需充分分散或裂解，确保目的蛋白尽可能的释放；
     热处理粗样时，确保升温迅速，并且金属浴或水温的实际温度达到100℃（在海拔较高处水的沸腾不能确保温度）；
     离心的转速和时间足够；
     吸取上清液时尽量不要碰到中间层

     2.蛋白条带出现扭曲怎么办？

     原因分析：分离胶的浓度与蛋白分子量不对应；灌胶时间过长或过短，导致丙烯酰胺的交联度不均匀

     解决办法：根据目的蛋白的分子量选择正确的分离胶浓度；
制备分离胶与浓缩胶时，应保证缓冲液母液的正确稀释，以及各组分的充分混匀（仅用移液器吹吸是不够的，可以迅速用磁力搅拌器进行混匀）

     3.转膜后没有指示条带怎么办?

     原因分析：如果此时SDS-PAGE胶上也没有指示剂，则表明转膜时间过长，蛋白穿膜（此时就没有再继续做下去的必要了）

     解决办法：注意控制转膜时间；
电泳液反复使用也可能导致转膜失败

     4.抗体孵育不均匀怎么办？

     原因分析：孵育时振荡摇床转速过快，或是混匀直径不够，导致孵育不充分或不均匀

     解决方法：确保摇床可以在50 rpm稳定运行；选择振荡直径在5~10 mm范围内的摇床