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细胞DNA转染方法
更新时间:2013-06-06      阅读:2489

                            细胞DNA转染方法

 
对于大部分细胞系 DNA与DNAfect的比例在1:21:3时转染效率较高。为了提转化效率、达水平并少细胞毒性,实验应在细胞密度较大时进行转染。以下操作以24孔板每孔细胞的DNA转染操作为例。
1.      贴壁细胞转化前一天在24孔板的每孔中加入500 μl无抗生素的生长培养基并于每孔中接种0.5-2×105个细胞,待细胞长至80-90%满时进行转染。
悬浮:在细胞之前,在24板的每孔加入500  μl无抗生素的生养基,并孔中接种3-5×105
个细胞。
2.      转染当天,首先准备转染复合物,对于每孔细胞按照以下用量配制:
a.  取适量DNA,加入25 μl无血清培养基,并轻轻的混合均匀。
b.  取适量DNAfect,加入25 μl无血清培养基,轻轻混匀,并于室温孵育5分钟。
c.  孵育5分钟之后,将稀的DNA和稀的DNAfect合(使DNA及DNAfectin的终总体积为50  μl),轻轻 混合均匀,并在室温下孵育20分钟(溶液可能会出现絮状,但不会影响转染效率) 注意:该混合物在室温下可以稳定保存6小时。
3.      将步骤1中24孔板中培养的细胞生长培养基更换成450 μl无血清培养基然后将步骤2中50 μl转染复合物加入到
24细胞孔板内,轻轻前后推动24孔板以混匀。
4.      将细胞置于含5%CO2,37条件下培养4-6小时后,更换成500  μl生长培养基。
5.      18-48小时后进行转染基因表达的检测。
6.      对于稳定的细胞系:在转染24小时后,细胞按照1:10的比例传代,第二天可加入筛选培养基进行筛选。
(1)  该说明一个24孔的用量若同时转几个孔配制转染复合物的量需加倍若转染其他类型孔板DNA和DNAfect见附表,该附表用量以293T细胞为转染细胞时的标准用量。
(2)  转染4-6小时后可以不更换养基,但由于DNAfect具有细胞毒性,间过长可能使细胞出现大死亡现 象,建议更换生长培养基。
(3)  优化条件:想要得到更高的转效率,应优化转条件:培养物、DNA浓度、细胞和细胞与DNA合物的孵育时间条件都 应进行优化。
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