细胞DNA转染方法
对于大部分的细胞系, DNA与DNAfect的比例在1:2至1:3时转染效率较高。为了提高转化效率、表达水平并且减少细胞毒性,实验应在细胞密度较大时进行转染。以下操作以24孔板每孔细胞的DNA转染操作为例。
1. 贴壁细胞:转化前一天,在24孔板的每孔中加入500 μl无抗生素的生长培养基,并于每孔中接种0.5-2×105个细胞,待细胞长至80-90%满时进行转染。
悬浮细胞:在细胞转染之前,在24孔板的每孔中加入500 μl无抗生素的生长培养基,并于每孔中接种3-5×105
个细胞。
2. 转染当天,首先准备转染复合物,对于每孔细胞按照以下用量配制:
a. 取适量DNA,加入25 μl无血清培养基,并轻轻的混合均匀。
b. 取适量DNAfect,加入25 μl无血清培养基,轻轻混匀,并于室温孵育5分钟。
c. 孵育5分钟之后,将稀释的DNA和稀释的DNAfect混合(使DNA以及DNAfectin的终总体积为50 μl),轻轻 混合均匀,并在室温下孵育20分钟(溶液可能会出现絮状,但不会影响转染效率) 注意:该混合物在室温下可以稳定保存6小时。
3. 将步骤1中24孔板中培养的细胞生长培养基更换成450 μl无血清培养基,然后将步骤2中50 μl转染复合物加入到
24细胞孔板内,轻轻前后推动24孔板以混匀。
4. 将细胞置于含5%CO2,37℃条件下培养4-6小时后,更换成500 μl生长培养基。
5. 18-48小时后进行转染基因表达的检测。
6. 对于稳定的细胞系:在转染24小时后,细胞按照1:10的比例传代,第二天可加入筛选培养基进行筛选。
注:(1) 该说明为一个24孔的用量,若同时转几个孔,配制转染复合物的量需加倍;若转染其他类型孔板,DNA和DNAfect用量见附表,该附表用量以293T细胞为转染细胞时的标准用量。
(2) 转染4-6小时后也可以不更换生长培养基,但由于DNAfect具有一定的细胞毒性,作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现 象,建议更换生长培养基。
(3) 优化条件:想要得到更高的转染效率,应优化转染条件:培养物、DNA浓度、细胞数和细胞与DNA复合物的孵育时间等条件都 应进行优化。